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manbet手机版小鼠基因修饰

manbet手机版简介

manbet手机版2007年诺贝尔生理学或医学奖授予马里奥·r·卡佩基、马丁·j·埃文斯和奥利弗·史密斯博士，以表彰他们发现了利用胚胎干细胞在小鼠体内引入特定基因修饰的原理。manbet手机版他们的工作使修改哺乳动物种系中的特定基因成为可能，并培养出携带和表达修改过的基因的后代。manbet手机版由Capecchi, Evans和Smithies开发的实验遗传方法工具箱，通常被称为敲除技术，使科学家能够确定特定基因在发育、生理和病理中的作用。manbet手机版它彻底改变了生命科学，并在医学治疗的发展中发挥了关键作用。

manbet手机版这些发现

manbet手机版马丁·埃文斯鉴定并分离了早期胚胎的胚胎干细胞，成年机体的所有细胞都是从这个细胞中衍生出来的。manbet手机版他将其建立在细胞培养中，对其进行基因改造，并将其重新引入养母体内以产生转基因后代。manbet手机版Mario Capecchi和Oliver Smithies各自独立地发现了如何利用DNA分子片段之间的同源重组来靶向哺乳动物基因组中的基因，并开发出了生产转基因小鼠的方法。manbet手机版这种动物在医学研究中已经变得不可或缺。manbet手机版此外，在导致“敲除小鼠”的研究中获得的有关干细胞生物学和基因技术的知识改变了我们对正常发育和疾病过程的理解，并为医学治疗找到了新的途径。manbet手机版图1显示了小鼠基因靶向的一般策略。

manbet手机版图1所示。manbet手机版小鼠基因靶向的一般策略。 manbet手机版一)manbet手机版胚胎干细胞的基因靶向培养，然后克隆一个胚胎干细胞系包含所需的突变。manbet手机版采用正负选择法富集含有修饰基因的ES细胞。 manbet手机版B)manbet手机版这些ES细胞被注射到囊胚中，囊胚被注射到养母体内，从而产生能够将突变基因传递给后代的嵌合小鼠。manbet手机版为了便于分离所需的子代，ES细胞和受体囊胚来源于具有不同毛色等位基因的小鼠。manbet手机版在图中，基因靶向的ES细胞及其后代显示为红色，囊胚显示为黄色。

manbet手机版导致基因靶向的研究

manbet手机版胚胎干细胞

manbet手机版干细胞是一种具有广泛增殖能力的细胞，能够产生更多的干细胞(自我更新)以及分化程度更高的细胞后代。manbet手机版体细胞干细胞是成体组织更新所必需的。manbet手机版例如，骨髓中的造血干细胞分化为血细胞，即红细胞、巨核细胞/血小板和不同类型的白细胞。manbet手机版虽然成年机体的每一个体细胞干细胞都有特定的分化系，但早期胚胎的干细胞是全能的，也就是说，它们能在发育中的机体中产生所有类型的细胞。manbet手机版因此，从胚泡中提取的胚胎干细胞可以用来创造一个活的哺乳动物有机体的想法多年来一直吸引着科学家们。

manbet手机版分化的细胞和组织来源于未分化的干细胞(Stammzellen)的概念早在一百年前就被提出了manbet手机版[1]manbet手机版．manbet手机版然而，几十年来，它们的确切性质仍然难以捉摸。manbet手机版睾丸畸胎瘤的研究表明，这些肿瘤含有全能细胞。manbet手机版20世纪50年代，杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的Leroy Stevens发现，携带129Sv基因的小鼠患此类肿瘤的频率很高。manbet手机版他证明了它们的细胞可以发育成胚状体，即胚胎细胞的聚集体。manbet手机版当移植时，这些聚集物可以诱导多种不同细胞类型的实体肿瘤manbet手机版(2、3)manbet手机版．manbet手机版几年后，Kleinsmith和Pierce证明这种肿瘤来源于未分化的胚胎癌细胞manbet手机版［4］manbet手机版．

manbet手机版细胞培养技术的发展使研究人员能够从小鼠睾丸畸胎癌中培养胚胎癌细胞(EC细胞)。manbet手机版包括剑桥大学的马丁·埃文斯(Martin Evans)在内的几位科学家在70年代初对这种文化进行了研究manbet手机版[5 - 7]manbet手机版．

manbet手机版Evans从Stevens那里获得129Sv小鼠，建立了小鼠群体，并在培养中对畸胎瘤源性细胞进行了表征manbet手机版(8、9)manbet手机版．manbet手机版这些胚胎癌(EC)细胞可以在受照射的成纤维细胞的饲养层上生长。manbet手机版当后者被撤回，广泛manbet手机版在体外manbet手机版发生分化。manbet手机版它通过原始的胚胎内胚层，凝聚成胚状体。manbet手机版附着在固体表面可产生各种类型的细胞，包括皮肤、神经、跳动的心肌等。manbet手机版这表明EC细胞的分化与小鼠胚胎内细胞团的分化方式相同manbet手机版(8、9)manbet手机版．

manbet手机版埃文斯认为，利用这些EC细胞不仅可以进行细胞培养研究，还可以创造嵌合小鼠。manbet手机版为了实现这一愿景，他与牛津大学的理查德·加德纳(Richard Gardner)建立了合作关系，后者将EC细胞注射到囊胚中，并将其重新植入寄养小鼠体内。manbet手机版后代是嵌合的，几乎每个组织都有EC细胞的贡献manbet手机版[10]manbet手机版．manbet手机版与此同时，其他几个小组也得出了类似的发现，manbet手机版[11]manbet手机版[12]manbet手机版．manbet手机版然而，携带EC衍生细胞的嵌合小鼠发展成多种肿瘤，并不能贡献于生殖系，因为核型异常。

manbet手机版埃文斯很明显地意识到，如果要从培养的胚胎干细胞中获得生殖系传播，就必须采用另一种策略。manbet手机版他利用单克隆抗体对EC细胞的细胞表面大分子及其正常对应物进行了表征，从而识别出早期分化的分子标记manbet手机版[13]manbet手机版．manbet手机版结果表明，可以找到与EC细胞表型相似的正常细胞用于实验。manbet手机版1980年，埃文斯与胚胎学家马特·考夫曼(Matt Kaufman)合作，将细胞培养和胚胎操作结合起来。manbet手机版正如埃文斯在后来的评论中所描述的manbet手机版[14]manbet手机版他原本打算用单倍体胚胎进行细胞培养，但准备了一些二倍体胚胎作为对照。manbet手机版埃文斯写道manbet手机版[14]manbet手机版：

manbet手机版“当我在组织培养中培养这些胚泡作为外植体时，使用的培养基是为了获得小鼠和人类EC细胞的最佳克隆效率而精心设计的，我立即注意到EC样细胞的生长。manbet手机版这些细胞可以清楚地识别为备受追捧的多能细胞，它们通过了每一项测试:它们在体内形成畸胎瘤，在体外分化。manbet手机版它们带有我们预期的细胞表面抗原。manbet手机版它们的碱性磷酸酶染色呈强阳性，核型正常，最重要的是，形成了精彩的嵌合体。”

manbet手机版这些细胞就是胚胎干细胞(ES细胞)，对基因靶向的成功至关重要。manbet手机版1981年7月，埃文斯和考夫曼在《自然》杂志上发表了他们关于胚胎干细胞的研究报告manbet手机版[15]manbet手机版．manbet手机版埃文斯的前同事盖尔·马丁(Gail Martin)在半年后也报告了类似的发现manbet手机版[16]manbet手机版．manbet手机版在《自然》杂志发表的论文中，埃文斯和考夫曼指出了利用胚胎干细胞进行基因改造的可能性。manbet手机版他们写道manbet手机版[15]manbet手机版：

manbet手机版“它们(即ES细胞)被用作将突变等位基因转移到小鼠基因组的载体，要么在细胞培养中选择，要么通过特定DNA片段转化插入细胞，这是一个有吸引力的命题。manbet手机版在许多这类研究中，使用从被研究胚胎中直接分离的多能细胞应该有很大的优势。”

manbet手机版埃文斯的团队建立了囊胚注射技术，以测试胚胎干细胞是否真的能促进生殖细胞的功能，从而用于创造嵌合小鼠。manbet手机版1984年，他们在《自然》杂志的另一篇里程碑式的论文中报道了种系成功的传播manbet手机版[17]manbet手机版．

manbet手机版下一步是确定胚胎干细胞是否可以用于将遗传物质引入生殖系。manbet手机版埃文斯和他的同事先用重组逆转录病毒感染胚胎干细胞，然后将其注射到囊胚中manbet手机版[18]manbet手机版．manbet手机版逆转录病毒DNA在创始者中被鉴定出来，并传递给F1后代，证明了外来DNA进入老鼠种系manbet手机版[19]manbet手机版．manbet手机版1986年10月，埃文斯等人在《自然》杂志上发表了他们的发现，并得出结论manbet手机版培养的胚胎细胞为生产转基因动物提供了一种有效的手段。manbet手机版[19]manbet手机版．manbet手机版同年12月，另一个实验室报告了一种新霉素耐药基因的种系传播，他们通过逆转录病毒感染将这种基因引入了胚胎干细胞manbet手机版[20]manbet手机版．

manbet手机版埃文斯现在迈出了重要的一步，将一种特定的内源性基因的突变形式引入老鼠基因组。manbet手机版他和他的同事转移了一个次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的突变基因，该基因在Lesch-Nyhan综合征(一种嘌呤代谢的x连锁单基因缺陷)中有缺陷manbet手机版[21]manbet手机版．manbet手机版通过培养的逆转录病毒感染，几个突变的HPRT基因拷贝被引入到ES细胞的基因组中。manbet手机版突变的ES细胞被注射到囊胚中，导致嵌合体。manbet手机版突变通过生殖系传播，在雄性后代中被鉴定为HPRT活性的丧失。manbet手机版爱丁堡的胡珀等人在《自然》杂志上发表了一篇与埃文斯实验室的论文并列的论文，报告了另一种突变的HPRT基因的种系传播，这是ES细胞中的一种自发缺失突变manbet手机版[22]manbet手机版．manbet手机版人类疾病的模型首次通过对胚胎干细胞的基因操作而建立。

manbet手机版在他们的论文中manbet手机版[21]manbet手机版，埃文斯和他的同事指出，他们的成功manbet手机版"开启了衍生出带有其他基因特异性诱导改变的菌株的可能性"manbet手机版和建议manbet手机版通过与体外修饰的克隆拷贝的同源重组，最终也可能在内源性基因中产生特定的改变。manbet手机版他引用了卡佩基和史密斯的研究manbet手机版(23、24)manbet手机版．manbet手机版事实上，这两种技术的结合彻底改变了实验医学，正如我们在近20年后所知道的那样。

manbet手机版哺乳动物的基因靶向和转基因

manbet手机版转基因小鼠

manbet手机版几十年来，老鼠一直是基因研究中最受欢迎的动物，也是首次尝试将新基因引入哺乳动物基因组的明显选择。manbet手机版几个实验室的工作已经确定了在培养中处理受精卵和囊胚的条件。manbet手机版利用这些培养技术，SV40病毒DNA被引入胚泡，随后被植入假怀孕的养母体内。manbet手机版在后代中可以检测到SV40 DNA，但不可能确定该DNA是否整合到宿主基因组中，还是保留为集集manbet手机版[25]manbet手机版．manbet手机版几年后，通过感染莫洛尼白血病病毒的胚胎，培育出了第一只转基因小鼠manbet手机版[26]manbet手机版．manbet手机版病毒RNA的DNA副本存在于转基因小鼠的基因组中，并以孟德尔方式转移到后代，因此病毒DNA已被引入小鼠种系。manbet手机版随后的发展使得在老鼠和其他哺乳动物中引入和过表达大量转基因成为可能manbet手机版[27]manbet手机版．manbet手机版然而，基因组中外源DNA的整合是随机发生的，复制的数量也各不相同。manbet手机版虽然这类转基因技术是生命科学中的一种重要工具，但在插入基因方面缺乏精确度，不能用于以预定的方式操纵内源基因。manbet手机版这些转基因过表达技术的固有问题限制了它的实用性。

manbet手机版同源重组

manbet手机版同源基因重组的原理在半个世纪前就已为人所知，并获得了诺贝尔奖manbet手机版约书亚莱德博格manbet手机版1958年他在细菌方面的研究。manbet手机版在70年代，人们发现真核生物在减数分裂过程中使用类似的机制来调节同源染色体之间的遗传信息交换。manbet手机版在酵母的早期研究之后，通过实验证明了哺乳动物基因组中的逆转录病毒DNA序列与引入的低聚逆转录病毒DNA之间的重组。manbet手机版开创性的工作manbet手机版理查德·阿克塞尔manbet手机版(2004年诺贝尔奖，因发现气味感受器)表明，胸苷激酶缺陷的培养哺乳动物细胞可以通过引入疱疹病毒胸苷激酶(manbet手机版tkmanbet手机版)基因manbet手机版[28]manbet手机版．manbet手机版马里奥·卡佩基决定改进这种方法，他使用一种精细的玻璃移液管将DNA直接注入细胞核manbet手机版[29]manbet手机版．manbet手机版这大大提高了基因转移的效率，Capecchi的方法很快被其他研究人员采用，将新基因引入受精卵的小鼠胚胎，并产生转基因小鼠manbet手机版[30]manbet手机版．manbet手机版然而，转移的基因仍然是在宿主基因组中随机引入的。

manbet手机版卡佩基现在做了一个关键的观察:当manbet手机版tkmanbet手机版基因被注入，拷贝只整合在宿主基因组的一个或两个位点上，多个拷贝形成首尾连接体。manbet手机版他推断，这种连接体只能通过两种机制产生:要么通过复制，要么通过同源重组。manbet手机版一系列细致的实验表明，头尾连接体是由同源重组产生的manbet手机版[31]manbet手机版．manbet手机版这反过来又提供了证据，证明哺乳动物体细胞具有介导同源重组的高效酶机制。manbet手机版如果这种机制能够被利用来完成新引入的DNA分子和受体细胞基因组中相同DNA序列之间的同源重组，那么任何细胞基因都可能发生突变。

manbet手机版Capecchi现在向美国国立卫生研究院提交了一份拨款提案，以测试在哺乳动物细胞中基因靶向的可行性。manbet手机版因为审稿人认为，引入的DNA在宿主基因组中找到匹配序列的可能性极低(Capecchi在后来的评论中引用了这一观点)，所以被拒绝了manbet手机版[32]manbet手机版) !manbet手机版差不多在同一时间，马丁·埃文斯manbet手机版等manbet手机版在向英国医学研究委员会提交的拨款申请中提出了类似的策略，也被拒绝了，原因是野心太大!

manbet手机版尽管被NIH拒绝，卡佩基还是决定继续进行同源重组研究。manbet手机版他生成了携带有缺陷的新霉素抗性基因(neo^{manbet手机版r}manbet手机版)，并能够通过引入功能性neo来修复它^{manbet手机版r}manbet手机版基因manbet手机版[23]manbet手机版．manbet手机版校正发生的频率相对较高(每1000个注射细胞中有一个)，这使得同源重组可能被用于操纵哺乳动物基因组的基因。

manbet手机版与卡佩基的工作并行的是，奥利弗·史密斯提出了同源重组可能被用于修复突变基因的概念。manbet手机版早在20世纪60年代，他就已经确定了通过重组事件发生的触珠蛋白的等位基因变体manbet手机版[33]manbet手机版．manbet手机版后来，他克隆了人类胎儿珠蛋白基因，得出结论^{manbet手机版G}manbet手机版γ和^{manbet手机版一个}manbet手机版γ是通过一个涉及同源重组的过程产生的manbet手机版[34]manbet手机版．manbet手机版他设计了一种逐步选择程序，以恢复携带修饰基因的靶细胞。manbet手机版这种策略是成功的，他在1985年9月19日出版的《自然》杂志上发表了一篇具有里程碑意义的论文，成功地将一个质粒通过同源重组整合到人类红白血病细胞的染色体β-珠蛋白基因中manbet手机版[24]manbet手机版．

manbet手机版到1985年，Capecchi已经证明了同源重组在哺乳动物细胞中发生的频率很高，smith已经使用同源重组将质粒DNA序列插入到人类细胞的染色体基因中。manbet手机版然而，所有这些工作都是在细胞培养中进行的。manbet手机版同源重组能否用于种系的靶基因，获得转基因动物品系?manbet手机版卡佩基和史密斯都听说过马丁·埃文斯的胚胎干细胞，并决定试一试。manbet手机版在Evans的帮助下，他们都建立了用于同源重组实验的ES细胞培养。

manbet手机版史密斯首次使用同源重组来纠正培养的ES细胞中突变的HPRT基因manbet手机版[35]manbet手机版．manbet手机版为此，我们使用了携带缺失突变的ES细胞系;manbet手机版这种细胞系以前曾被用于生产突变小鼠。manbet手机版用携带缺失启动子和前2个外显子的质粒修复HPRT基因，史密斯表明处理过的细胞在HAT选择培养基中存活和生长，这需要HPRT酶活性。manbet手机版史密斯和他的合著者得出结论manbet手机版“对多能性胚胎干细胞中选定的基因进行修饰，证明了以预先确定的方式操纵哺乳动物基因组的可行性。”manbet手机版[35]manbet手机版．

manbet手机版Capecchi的团队也选择了HPRT基因进行早期研究。manbet手机版用HPRT酶选择性培养细胞的标准方法已经有好几年了，已经用于选择突变体、单克隆抗体生产中的杂交瘤细胞等。manbet手机版托马斯和现年manbet手机版[36]manbet手机版在ES细胞的HPRT基因外显子中引入一个新霉素耐药基因，结果表明转染细胞的克隆失去了HPRT，但获得了新^{manbet手机版R}manbet手机版活动。manbet手机版他们在《细胞》杂志的论文中总结道manbet手机版“我们希望，利用ES细胞作为受体细胞系和通过基因靶向实现位点特异性突变的结合，将为产生任何所需基因型的小鼠提供手段。”manbet手机版[36]manbet手机版他们接着概述了一个实验性的策略:

manbet手机版“这种情况的一个优点是，第一代嵌合体对于目标突变通常是杂合子的，后续育种可以用来产生纯合子的动物。manbet手机版因此，两个位点中只有一个需要灭活，隐性致死基因可以保持为杂合子。manbet手机版如果成功，这项技术将在未来被用于解剖老鼠的发育途径，并为人类疾病生成老鼠模型。”manbet手机版[36]

manbet手机版这一愿景已经成为现实，现在是实验医学的基石。

manbet手机版重要的是要从“模式基因”HPRT发展到一种通用策略，以靶向那些在细胞培养中无法选择功能的基因。manbet手机版托马斯和现年manbet手机版[36]manbet手机版已经指出，同源重组与随机整合的频率是1/ 1000，这应该足够高，以允许靶向非选择基因。manbet手机版这一观察结果促使人们着手开发这种方法所需的方法。manbet手机版第二年，Capecchi的阳性-阴性选择策略在《自然》杂志上发表，该策略富集了含有靶向破坏任何转染基因的ES细胞manbet手机版[37]manbet手机版(图2)一种新霉素耐药元件(neo^{manbet手机版R}manbet手机版)被引入到替换载体的外显子中，该外显子的末端也有一个胸苷激酶(HSV-tk)元件。manbet手机版目标基因的同源重组将产生neo^{manbet手机版R}manbet手机版但由于tk元素不在重组DNA序列之外，因此会丢失。manbet手机版相比之下，替换向量的随机积分将引入tk和neo^{manbet手机版R}manbet手机版到基因。manbet手机版这个策略被成功地用来破坏manbet手机版int-2manbet手机版该基因是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一员manbet手机版[37]manbet手机版．

manbet手机版现在，生产基因靶向小鼠株的所有要素都已具备:胚胎干细胞培养的发展，证明胚胎干细胞中的基因修饰可以传递到种系并在后代中登记，观察到哺乳动物基因组中同源重组发生的频率高，基因转移方法在胚胎干细胞中的应用，以及富集转染细胞的策略的发明。manbet手机版几个实验室加入了这场竞赛，1989年见证了几种不同的敲除小鼠的诞生manbet手机版(38-41)manbet手机版．manbet手机版图3显示了Smithies和同事对种系突变HPRT基因进行修正的分子证据manbet手机版[39]manbet手机版．

manbet手机版基因靶向技术的进一步发展

manbet手机版基因靶向技术建立后，在几个实验室进行了一些重要的改进和发展，在很大程度上扩展了它的应用。manbet手机版通过引入Cre重组酶(所谓的lox)的识别位点，基因靶向的巧妙发展已经实现^{manbet手机版P}manbet手机版位点，进入现有基因。manbet手机版当携带这种“floxed”基因的小鼠与表达Cre重组酶的转基因小鼠交配时，子代的靶基因通过Cre作用被修饰manbet手机版(42-44)manbet手机版．manbet手机版另一种位点特异性重组酶，Flp，也经常被用于构建小鼠基因的条件靶向manbet手机版[45]manbet手机版．manbet手机版Cre或Flp基因的活性可以通过将其置于合适的启动子下来实现组织特异性基因靶向manbet手机版[46]manbet手机版．manbet手机版Cre的表达和floxed基因的靶向可以局限于T细胞(lck启动子)、心肌(心肌肌球蛋白启动子)、神经元(烯醇化酶启动子)或上皮细胞(细胞角蛋白启动子)。

manbet手机版通过在启动子中引入一个需要配体(如药物)诱导的元素，也可以暂时控制Cre的表达manbet手机版[47]manbet手机版．manbet手机版四环素、i型干扰素和它莫西芬(与雌激素受体结合元素结合)都被用于获得药物诱导启动子。manbet手机版这样，就可以通过给药来靶向想要的基因。manbet手机版通过将他莫西芬位点引入到组织特异性启动子中，当用该药物治疗小鼠时，可以在特定组织中选择性地获得基因靶向。

manbet手机版creo -lox技术也可以用来用另一个基因替换现有的基因manbet手机版[48]manbet手机版．manbet手机版这种"敲入"已被使用，例如用人类的免疫球蛋白或MHC基因取代小鼠的免疫球蛋白或MHC基因，以便在免疫功能方面使小鼠"人性化"。manbet手机版它还被用来用另一个等位基因替换一个等位基因，例如，后者是一个被怀疑会引起疾病的等位基因。

manbet手机版基因靶向在生理和医学上的意义

manbet手机版基因靶向技术通过允许对特定基因功能的假设进行实验测试，改变了科学医学。manbet手机版在基因靶向之前，我们对基因在高等生物中的作用的理解是从对患者和实验动物的自发突变的观察、连锁和关联研究、对动物的基因产物管理，以及在某种程度上来自细胞培养实验。manbet手机版然而，细胞培养对了解涉及多细胞综合反应的功能和疾病没有帮助。manbet手机版对诸如神经系统、心血管系统和免疫系统等器官系统的了解，充其量也只是支离破碎的，对哺乳动物发育的了解也是如此。manbet手机版正如心血管生理学家Heimo Ehmke所说，manbet手机版“细胞没有血压”manbet手机版[49]manbet手机版．manbet手机版通过观察破坏候选基因对完整生物体的影响，改变了这些研究领域。manbet手机版例如，心血管生理学家为了研究血液动力学的遗传调节，将大鼠模型换成了小鼠模型，缩小了仪器和技术的规模。manbet手机版一个基因生理学的新时代诞生了。

manbet手机版人类和老鼠的基因组包含大约22400个基因。manbet手机版他们中的几千人已经通过基因靶向进行了研究。manbet手机版总的来说，这些研究提供了关于基因在发育和疾病中的功能的丰富信息。manbet手机版它们促进了机制分子生物学与胚胎学、生理学和免疫学等综合生命科学的融合，并促进了生理科学的新技术发展。manbet手机版在医学上，通过基因靶向小鼠对人类疾病的建模提供了特别丰富的信息。

manbet手机版在这个阶段，概括克劳德·伯纳德首先提出的医学科学方法的标准可能是有帮助的manbet手机版[50]manbet手机版医学科学家通过观察、假设和推论对自然现象提出解释和理论。manbet手机版用实验验证了这些理论的预测。manbet手机版任何足以作出预测的理论都可以用这种方法进行重复检验。manbet手机版因此，科学方法本质上是一种谨慎的手段，以建立对我们的自然世界的可支持的、基于证据的理解。manbet手机版实验在这一过程中至关重要。

manbet手机版在基因靶向技术出现之前，基因医学缺乏实验检测手段。manbet手机版如果我们做一个类比manbet手机版罗伯特•科赫manbet手机版美国对传染病的研究方法manbet手机版[51]manbet手机版在美国，遗传医学可以应用科赫的第一个假设(即观察微生物，或在这种情况下，基因或等位基因与疾病之间的联系)，随着基因克隆的出现，第二个假设(从患病个体中分离出微生物/基因并在培养中建立它)，但应用科赫的第三个假设(通过将微生物/基因转移到宿主有机体中诱发疾病)需要基因靶向。manbet手机版通过突变基因来破坏其功能(敲除)或将其转换到与疾病相关的等位基因(敲入)，如果假设是正确的，疾病就会诱发。manbet手机版目前正在开发基于遗传流行病学的替代方法，但目前可用的方法没有基于假设的实验的精度manbet手机版．manbet手机版这种对科学理论的偏离可能足以说明这一点:只有以候选基因为目标，才有可能正式建立基因和疾病之间的因果关系。manbet手机版现在让我们来看看基因靶向在医学上影响的一些具体例子。

manbet手机版图3。manbet手机版修复的HPRT基因种系传播的分子遗传学证据。manbet手机版从裁判manbet手机版[39]manbet手机版．manbet手机版Southern blot显示基因组DNA杂交到靶向载体中特定序列的探针上。manbet手机版ES细胞来自刺豚鼠，胚泡来自黑鼠，HPRT基因位于X染色体上。manbet手机版肿瘤来自携带靶向基因的嵌合小鼠，靶向ES细胞系也是如此。manbet手机版在F1后代中，靶向ES细胞衍生的雌性刺豚鼠携带靶向HPRT基因，而受体囊胚衍生的黑鼠和雄性刺豚鼠均不存在该基因。manbet手机版下半部分为靶向策略，HPRT基因缺失突变(a)，靶向结构(b)， HPRT基因经基因靶向校正(c)，探针(19*)用于杂交(d)。manbet手机版经许可，转载自《美国国家科学院院刊》。manbet手机版版权所有1989美国国家科学院

manbet手机版单基因疾病

manbet手机版在哺乳动物基因靶向诞生后，实验遗传学家关注的第一个领域是单基因疾病。manbet手机版的manbet手机版Lesch-Nyhan综合症manbet手机版实际上，在埃文斯和史密斯的实验室(见上文)，该技术的发展过程中，它是一种由HPRT基因突变引起的核苷酸代谢缺陷。manbet手机版选择这种特殊医疗条件的原因之一是，分离转导细胞的选择条件可用于HPRT。manbet手机版HPRT-/-小鼠的第一次试验令人失望，因为既没有观察到人类疾病的神经病理学特征，也没有观察到人类疾病的行为特征manbet手机版(21日39)manbet手机版．manbet手机版这促使了对小鼠嘌呤回收途径的分析，并导致小鼠在很大程度上依赖腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)来回收嘌呤，因此对HPRT缺乏不像人类那样敏感。manbet手机版给HPRT-/-小鼠注射一种APRT抑制剂可诱导与人类疾病临床特征相似的持续性自我伤害行为manbet手机版[52]manbet手机版．manbet手机版这说明，在对基因靶向小鼠的表型进行表征时，需要对综合功能进行复杂的分析。

manbet手机版囊性纤维化manbet手机版是最常见的单基因疾病之一，史密斯和他的同事选择它进行基因靶向研究manbet手机版[53、54]manbet手机版．manbet手机版该缺陷基因已在患者家庭中进行连锁研究，随后进行分子克隆。manbet手机版结果发现它是一个camp激活的脉络通道，被称为囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)。manbet手机版通过敲除小鼠体内的CFTR，产生了一种重现人类疾病许多特征的疾病。manbet手机版因此，CFTR-/-纯合子在气道和肠道上皮中表现出氯离子运输缺陷、生长失败、胎粪肠梗阻和胃肠道腺体病理改变。manbet手机版这些研究是第一批通过基因靶向小鼠建立人类疾病模型的研究之一。manbet手机版紧随其后的是大量这样的顶级车型。

manbet手机版的发病机制manbet手机版遗传性心脏病manbet手机版基因靶向方法已经成功探索过了吗manbet手机版(55、56)manbet手机版．manbet手机版例如，靶向编码心肌细胞收缩器官成分的基因会导致心肌病;manbet手机版间隙连接蛋白的靶向突变导致传导缺陷;manbet手机版参与心脏发育的转录因子基因被破坏导致先天性心脏畸形;manbet手机版针对控制能量代谢的基因会导致心肌病。

manbet手机版复杂的疾病

manbet手机版涉及多个基因作用的复杂疾病，加上基因与环境的相互作用，对医学研究来说是一个特别的挑战。manbet手机版人们通常对遗传、渗透和相互作用知之甚少，很难剖析个体遗传因素的贡献，因果关系和相关性之间的区分也存在问题。manbet手机版为了在如此复杂的系统中证明因果关系，实验必须允许检测一次只改变一个变量的影响。manbet手机版基因定位使这类实验成为可能，并允许证明复杂疾病的因果关系。

manbet手机版心血管疾病

manbet手机版Oliver Smithies是这方面的领导者。manbet手机版他与Nobuyo Maeda一起专注于两种重要而复杂的疾病，高血压和动脉粥样硬化manbet手机版[57]manbet手机版)．manbet手机版双胞胎研究表明，遗传因素可能占约70%的家族聚集manbet手机版原发性高血压manbet手机版．manbet手机版然而，至少有10个基因已经被证明可以改变血压，而且它们的基因产物似乎以复杂的方式相互作用。manbet手机版尽管血管紧张素原(AGT)基因多态性与原发性高血压相关的研究已被发现，但对该疾病的遗传学仍知之甚少manbet手机版[58]manbet手机版．manbet手机版人们对与人类原发性高血压相关的基因数量、它们对血压的定量影响、它们的传播方式、以及它们与其他基因和环境成分的相互作用知之甚少。

manbet手机版史密斯怀疑基因剂量效应会影响血压水平，并设计了一种新的方法来滴定基因剂量，通过生产具有一个、两个或三个AGT基因功能副本的小鼠manbet手机版[59]manbet手机版．manbet手机版采用“传统”基因靶向法生产一、二拷贝小鼠，间隙修复基因靶向法生产三拷贝AGT基因小鼠。manbet手机版这导致基因产物(即血浆血管紧张素原蛋白)的比例更高，重要的是，随着基因拷贝数的增加，血压也相应升高。manbet手机版当•史密斯manbet手机版等manbet手机版针对另一个重要的血压调节基因，一个编码血管紧张素转换酶(ACE)，没有观察到这样的线性关系，尽管ACE抑制剂在降低血压的有效性。manbet手机版研究人员将他们的数据提交给复杂交互系统的计算机模拟，并提出了一个通过肾素-血管紧张素系统控制血压的模型，该模型已被证明对理解原发性高血压是有用的manbet手机版[60]manbet手机版．manbet手机版这表明，在评价血压的遗传调节时，必须考虑基因剂量、基因表达、基因产物清除/分解代谢。

manbet手机版1992年，Nobuyo Maeda，在北卡罗莱纳大学史密斯的部门工作，开发了一个老鼠模型manbet手机版动脉粥样硬化manbet手机版通过靶向载脂蛋白E基因(manbet手机版Apoemanbet手机版）manbet手机版[61]manbet手机版．manbet手机版洛克菲勒大学的研究人员对同样的基因进行了独立的研究manbet手机版[62]manbet手机版．manbet手机版的manbet手机版Apoe^{manbet手机版-/-}manbet手机版小鼠自发发生动脉粥样硬化，这与人类疾病非常相似。manbet手机版第二年,manbet手机版迈克尔·布朗和约瑟夫·戈德斯坦manbet手机版(1985年因在胆固醇代谢方面的发现而获得诺贝尔奖)和他们的同事将低密度脂蛋白受体基因(manbet手机版Ldlrmanbet手机版)，并获得了一只在喂食富含胆固醇的食物时发生动脉粥样硬化的老鼠manbet手机版[63]manbet手机版．manbet手机版介绍了两种有缺陷的小鼠模型manbet手机版Apoemanbet手机版而且manbet手机版Ldlrmanbet手机版基因完全改变了动脉粥样硬化的研究。manbet手机版通过将它们与其他基因靶向小鼠杂交，已经有可能推断出调节炎症、脂质代谢、血压和其他被认为与动脉粥样硬化性心血管疾病有关的因素的基因的重要性manbet手机版[64]manbet手机版．manbet手机版在制药工业中，它们也被大量用于开发和测试治疗冠状动脉疾病的新药。

manbet手机版癌症

manbet手机版基因靶向在癌症研究中一直非常有用。manbet手机版大量的原癌基因、肿瘤抑制基因、血管生成因子等被靶向于小鼠不同组织，以阐明肿瘤的诱导和扩散manbet手机版[65]manbet手机版．manbet手机版肿瘤抑制基因的基因靶向研究有助于阐明它们在肿瘤形成中的作用。manbet手机版例如，携带靶向p53基因的小鼠更容易发生肿瘤manbet手机版[66]manbet手机版．manbet手机版条件靶向(使用creo -lox技术)的APC基因诱导小鼠结直肠肿瘤，APC靶向小鼠已成为实体肿瘤研究的有用模型manbet手机版[67]manbet手机版．manbet手机版内皮生长因子和蛋白水解酶的基因靶向对于理解实体肿瘤新血管生成和转移的机制至关重要，也被用于制定防止肿瘤扩散的治疗策略manbet手机版[68]manbet手机版．

manbet手机版其他疾病

manbet手机版当代对大多数(如果不是所有)人类主要疾病的研究都涉及到在小鼠身上的基因靶向，并且有针对内分泌、代谢、神经、炎症和其他疾病的“敲除模型”。manbet手机版基因靶向小鼠模型在宿主防御病原体的研究中也变得越来越重要。manbet手机版事实上，基因靶向小鼠在医学研究的几乎所有方面都不可或缺。

manbet手机版结论

manbet手机版基因靶向改变了生理学和医学。manbet手机版在基础生物医学科学中，很难想象没有使用基因靶向模型的当代医学研究。manbet手机版在老鼠基因中产生可预测的设计突变的能力导致了对发育、免疫学、神经生物学、生理学和代谢的深入研究。manbet手机版它还允许在可控制的哺乳动物系统中生成人类病理疾病模型，从而使疾病状态的实验解剖成为可能，确定新的治疗靶点，并开发药理学测试系统。manbet手机版最后，很明显，未来纠正人类基因缺陷的新疗法的发展将建立在马里奥·卡佩奇、马丁·埃文斯和奥利弗·史密斯的发现为基础的小鼠基因修饰经验的基础上。

manbet手机版Goran K汉森
manbet手机版卡罗林斯卡学院心血管研究教授
manbet手机版诺贝尔生理学或医学奖委员会成员