manbet手机版诺贝尔奖演讲，1993年12月8日

manbet手机版聚合酶链反应

manbet手机版1944年manbet手机版欧文薛定谔manbet手机版在智力上受到manbet手机版马克斯·德尔布吕克manbet手机版出版了一本叫做manbet手机版生命是什么?manbet手机版它启发了第一批分子生物学家，并和Delbrück自己一起，被认为在接下来的十年中指导了研究，解决了“相似的人如何产生相似的人”的谜团。

manbet手机版马克斯在1969年被授予诺贝尔奖，他为此感到高兴，同时他也哀叹，他在全世界人民面前获得荣誉的工作，他觉得他只能与少数人分享。manbet手机版塞缪尔·贝克特manbet手机版在马克思看来，他在文学上的贡献，在受到表彰的同时，似乎是人人都能得到的。manbet手机版但不是他的。manbet手机版在这里的演讲中，马克斯想象着自己被囚禁在科学的象牙塔中。

manbet手机版“伟大科学家的著作，”他说，“在学术图书馆的书架上积满了灰尘。manbet手机版这样做是对的。manbet手机版这位科学家向为数不多的作曲家听众发表演说。manbet手机版他的信息并非缺乏普遍性，但这种普遍性是无形的、匿名的。manbet手机版艺术家的交流永远与它的原始形式联系在一起，而科学家的交流则被修改、放大，与他人的想法和结果融合在一起，并融入形成我们文化的知识和思想的洪流中。manbet手机版科学家和艺术家的共同点只有一点:他找不到比他的工作更好的逃避世界的方法，也找不到比他的工作更紧密地与世界联系的方法。”

manbet手机版我喜欢听Max的智慧Delbrück。manbet手机版就像我的其他历史英雄一样，manbet手机版理查德·费曼manbet手机版麦克斯有一种直接看到事物核心的方式，并把它澄清给我们其他人。

manbet手机版但我不同意马克斯的观点，认为科学创造的乐趣必须保持完全神秘和无法解释的状态，对所有人都封闭起来，只有少数了解内幕的同事才知道。manbet手机版在这件事上我倾向于费曼。manbet手机版我想费曼会说，如果你能理解，你就能解释。

manbet手机版我将试着解释我是如何发明聚合酶链式反应的。manbet手机版有一点不容易翻译成正常语言。manbet手机版如果在座的很多人对这部分不感兴趣，我就会把它删掉。manbet手机版我要做的是让你们知道当我们讲到这个的时候以及当我们完成这个的时候。manbet手机版别为这事烦恼了。manbet手机版它很深奥，也不重要。manbet手机版我认为你可以理解发明聚合酶链反应的感觉，而不需要关注细节。

manbet手机版1953年,当manbet手机版吉姆·沃森和弗朗西斯·克里克manbet手机版发表了DNA的结构，薛定谔的小书，那时我八岁。manbet手机版我太年轻了，没有注意到人类终于明白了“物以类聚”的道理。manbet手机版这本书重印了三次。manbet手机版我住在南卡州哥伦比亚，没有人注意到我们没有副本。manbet手机版但我家离一片未开发的林区只有几个街区，那里有一条小溪、负鼠、浣熊、毒蛇、龙，还有一条铁路。manbet手机版我们不需要副本。manbet手机版对我和我的兄弟们来说，这是一片荒野，一个不为人知、不受管制的地方。manbet手机版如果我们厌倦了地球，我们可以潜入城市下方的雨水渠网络。manbet手机版我们摸清了那个黑暗的地下迷宫。manbet手机版它总是让我们害怕。 And we always loved it.

manbet手机版1962年沃森和克里克在斯德哥尔摩被授予荣誉的时候，我和我的青少年伙伴们已经设计火箭三年了。manbet手机版作为燃料，我们发现硝酸钾和糖的混合物可以非常小心地在木炭炉上融化，然后以一种特殊的方式倒入金属管中，效果显著。manbet手机版随着我们不断的实验，管子越来越大，直到大约四英尺长。manbet手机版母亲变得更谨慎了，她经常从楼上的窗户探出头来，说些不太令人鼓舞的话。manbet手机版糖是不情愿地从她自己的厨房里提供的，硝酸钾是我们从当地的药店买的。

manbet手机版当时在南卡罗来纳，寻找化学药品的小男孩不会立即受到怀疑。manbet手机版我们甚至可以毫无疑问地从硬件设备购买炸药引信。manbet手机版这是件好事，因为有一次，当我们的火箭在发射台上爆炸时，由于我们使用了非常可靠的、缓慢燃烧的炸药引信，加上我们在引信被点燃后能够像风一样跑开，我们的引信才得以幸免于早期灭绝。事实上，我们的引信比阿尔弗雷德·诺贝尔吓唬自己母亲时使用的引信要好得多。万博体育安卓版appmanbet手机版在我们对周围成熟的年轻女性如此感兴趣，以至于在接下来的十年里都不会深入考虑火箭燃料之前，我们做了最后一次实验，我们把一只青蛙炸到一英里高的空中，并把它活着救了回来。manbet手机版另一次，我们无意中吓到了一名飞行员，他正在哥伦比亚机场准备一架DC-3飞机降落。manbet手机版我们的错误。

manbet手机版在德雷尔高中，我们可以自由地，不受监督地进入化学实验室。manbet手机版我们花了好几个下午在那里修修补补。manbet手机版没有人受到伤害，也没有引发诉讼。manbet手机版他们现在不让我们进去了。manbet手机版今天，我们会被认为是对社会的威胁。manbet手机版如果我没弄错的话，阿尔弗雷德·诺贝尔有一段万博体育安卓版app时间是不允许在瑞典的土地上施展他的魔法的。manbet手机版当然，在这些问题上，瑞典过去和现在都领先于美国一点。

manbet手机版我从不厌倦在实验室里摆弄东西。manbet手机版从佐治亚理工学院毕业的暑假期间，艾尔·蒙哥马利和我在小镇边上的一个旧鸡舍里建了一个有机合成实验室，我们在那里生产用于销售的研究化学品。manbet手机版其中大部分是有毒的，或者是爆炸性的。manbet手机版没有人想要制造它们，有人想要，所以它们的生产成为了我们的领域。manbet手机版我们没有无聊，也没有老板。manbet手机版我们赚了足够的钱买新设备。manbet手机版哥伦比亚有机化学公司的老板马克斯·格格尔是个特别好的人，他鼓励我们，买了我们大部分的产品，然后再转卖。manbet手机版没有政府监管机构扼杀我们初出茅庐的努力，那是一个黄金时代，但我们没有注意到。manbet手机版我们学了很多有机化学。

manbet手机版当我离开佐治亚理工学院去加州大学伯克利分校读生物化学研究生时，基因密码已经被破解了。manbet手机版我对DNA还不感兴趣。manbet手机版我对分子感到兴奋。manbet手机版聚合酶链反应之前的DNA又长又细，根本不是真正的分子结构。manbet手机版在生物化学系的六年没有改变我对DNA的看法，但在伯克利的六年几乎改变了我对其他一切的看法。

manbet手机版我在乔·尼兰兹(Joe Neilands)的实验室里，他为他的研究生们提供了一个工作的地方，几乎没有什么规矩。manbet手机版我甚至不确定乔是否知道除了社会责任和宽容的崇高道德基础之外的任何规则。manbet手机版由于不知道系里有规定，我选择了天体物理学而不是分子生物学，我想我可以从我的分子生物学朋友那里学习。manbet手机版我的第一篇科学论文发表在manbet手机版自然manbet手机版在1968年,。manbet手机版这是一个很幼稚的天体物理学假设叫做“时间逆转的宇宙学意义”。manbet手机版我认为manbet手机版自然manbet手机版现在还不好意思把它发表出来，但在我参加资格考试时，它对我非常有用。manbet手机版委员会将决定是否允许我在没有学过分子生物学的情况下攻读博士学位。manbet手机版我的论文在manbet手机版自然manbet手机版，帮助他们证明“是”是正确的。manbet手机版回想起来，该委员会的成员构成很有趣。

manbet手机版唐·格拉泽，在1960年34岁的时候获得了物理学奖，他后来是Cetus公司的创始人之一，我发明PCR的时候也在这家公司工作。manbet手机版发现补骨脂素的亨利·拉帕波特(Henry Rapaport)将成为我在鲸鲸学院(Cetus)的科学顾问，并与我共同撰写了两项专利。manbet手机版艾伦·威尔逊(Alan Wilson)，现在不幸去世了，他将是Cetus以外第一个使用PCR的研究人员。manbet手机版当我的第一篇聚合酶链反应的论文被《科学》杂志拒之门外时丹·科什兰是杂志的编辑三年后聚合酶链反应被评为年度分子时他也是编辑。manbet手机版我通过了。manbet手机版我想，当我们走出那个房间时，我们谁也没有意识到我们之间的事情会变成怎样。

manbet手机版在伯克利，这是一个社会动荡的时代，乔·尼兰兹是一个完美的导师，他带领他的人民优雅地度过了这段时期。manbet手机版每天下午4点，我们围坐在一张柚木桌子旁，一边喝茶，一边笑个不停。这张桌子是乔从家里带来的，一个月涂一次油。manbet手机版我们的实验室有一种特别的氛围。manbet手机版我决定成为一名神经化学家。manbet手机版乔是微生物铁转运分子方面的大师。manbet手机版大多数实验室不是这样做的，实验室的负责人更希望你通过详细介绍他的一些工作来帮助他发展事业。manbet手机版尼兰却不是这样。manbet手机版只要我写论文，拿到学位，他就不管我做什么，我就高高兴兴地呆在他的实验室里，跟着自己的好奇心走，即使它把我带进了音乐课程，只要乔认为我们可以不受影响。manbet手机版这个部门每月从国家卫生研究院给我发津贴，乔知道，最终我必须离开。

manbet手机版六年后，我带着博士学位和对教育的信心去了东方。manbet手机版结婚几个月后，我的妻子去了堪萨斯的医学院，我也跟着她去了那里。manbet手机版那是1972年。

manbet手机版我还没有在堪萨斯州工作的职业规划，所以我决定成为一名作家。manbet手机版我很快发现我还太小了。manbet手机版当时我对悲剧一无所知，我笔下的人物也很平淡。manbet手机版我不知道如何用别人能相信的术语来描述一个卑鄙的灵魂。

manbet手机版所以我不得不找一份科学家的工作。manbet手机版我在医学院找到了一个和两个儿科心脏病专家和一个病理学家一起工作的。manbet手机版这是一次非常幸运的意外。manbet手机版一方面，儿科医生总是最好的医生，另一方面，这些医生非常特别:利昂·马提奥利，他的妻子会做饭，阿戈斯蒂诺·莫尔特尼和理查德·扎克海姆。manbet手机版我花了两年时间做医学研究，从两个意大利人和一个纽约犹太人那里学会了如何欣赏旧世界的价值观，还第一次学习了人类生物学。

manbet手机版婚姻结束后，我回到伯克利，在一家餐馆工作了一段时间，然后在加州大学旧金山分校(University of California at San Francisco)杀老鼠取脑。manbet手机版我看了Max Delbrück的演讲，但我不认为我理解了他是谁的意义，我也没有受到他的影响而进入分子生物学。manbet手机版我在研究脑啡肽。

manbet手机版但后来有一个研讨会描述了生长抑素基因的合成和克隆。manbet手机版这让我印象深刻。manbet手机版我第一次意识到，重要的DNA片段可以用化学方法合成，而且很可能非常令人兴奋。manbet手机版我开始在图书馆研究DNA合成。manbet手机版我开始找一份制造DNA分子的工作。

manbet手机版鲸图斯在1979年秋天雇用了我。manbet手机版我工作很长时间，非常享受。manbet手机版DNA合成比杀老鼠有趣得多，旧金山湾区是做DNA合成的好地方。manbet手机版有一些生物技术公司和一些学术团体致力于改进DNA的合成方法。manbet手机版两年之内，我的实验室里就有了一台来自加州圣拉斐尔生物搜索公司(Biosearch)的机器，它生产寡核苷酸的速度远远快于Cetus的分子生物学家。manbet手机版我开始研究寡核苷酸想看看它们能做什么。

manbet手机版我隔壁的实验室是由亨利·埃利希(Henry Erlich)管理的，正在研究检测点突变的方法。manbet手机版我们为它们制造了一些寡核苷酸。manbet手机版我开始思考他们的问题，并提出了我自己的想法，他们最终将其称为寡聚物限制。manbet手机版只要目标序列相当集中，比如纯化质粒上的一个位点，它就会起作用，但如果这个位点相对稀少，比如人类DNA中的单个拷贝基因，它就不会起作用。

manbet手机版我向那些迷路的人道歉，但我现在不得不说一些很难的事情。manbet手机版我过几分钟再讲这个故事。

manbet手机版低聚物限制方法还依赖于这样一个事实，即感兴趣的目标包含一个限制位点多态性，这使它不能普遍适用于任何点突变。manbet手机版我开始考虑做一些实验，在只有二脱氧核苷三磷酸存在的情况下，杂交到特定位点的寡核苷酸可以被DNA聚合酶扩展。manbet手机版我推断，如果一个反应的四个等分中的每个等分中的一个二脱氧核苷三磷酸是有放射性的，那么通过分析凝胶上的等分，就可以表明是哪个二脱氧核苷三磷酸加到了杂化寡核苷酸上，从而确定哪个碱基与寡核苷酸的3 '端相邻。manbet手机版这就像在单碱基对上做桑格测序。

manbet手机版在人类DNA上，它不会起作用，因为寡核苷酸不会特定地结合到单个位点上。manbet手机版在像人类DNA这样复杂的DNA上，它可能会与成百上千个位点结合，这取决于所涉及的序列和所使用的条件。manbet手机版为了完成这项工作，我需要一些方法来提高特定地点的相对集中度。manbet手机版我需要的是PCR，但我没有考虑过这种可能性。manbet手机版我知道质粒中的5000个碱基对和人类基因组中的30亿个碱基对在数字上的区别，但不知怎的，它并没有像它应有的那样让我震惊。manbet手机版我的无知对我很有好处。manbet手机版我不停地想着我的实验，却没有意识到它永远不会成功。manbet手机版它变成了PCR。

manbet手机版一个星期五的晚上，我像往常一样开车从伯克利去门多西诺，在那里我有一间小屋，远离森林。manbet手机版我的女朋友詹妮弗·巴奈特(Jennifer Barnett)正在睡觉。manbet手机版我在想。manbet手机版既然寡核苷酸不再那么难制造了，那么在反应中加入两个寡核苷酸而不是一个，不是很简单吗?这样一来，一个寡核苷酸会与上链结合，另一个与下链结合，它们的三个'端与碱基对的相对碱基相邻。manbet手机版如果其中一个比另一个长，那么它们的单碱基延伸产物就可以在凝胶上彼此分离，一个可以作为另一个的对照。manbet手机版我无论如何都要用凝胶把它们从大量的放射性核苷磷酸中分离出来。manbet手机版我希望看到的是，其中一个会选择一个放射性核苷酸而另一个会选择它的补体。manbet手机版其他的组合则表明出了问题。manbet手机版这不是一个完美的控制，但它不需要很多努力。manbet手机版这将引导我去研究PCR。

manbet手机版我喜欢这种控制方式，因为它在成本和努力方面几乎是免费的。manbet手机版而且，这将有助于消耗我的实验室现在制造的寡核苷酸比它们被利用的速度要快。

manbet手机版那天晚上，当我开车穿过群山时，开满了花的加州七叶树的枝干都弯到了路上。manbet手机版空气潮湿凉爽，弥漫着令人陶醉的香气。

manbet手机版受思想实验进展的鼓舞，我继续思考它，思考可能出错的地方。manbet手机版例如，如果DNA样本中含有脱氧核苷三磷酸会怎样?manbet手机版将会发生什么?manbet手机版我推断，接下来会发生的情况是，在链伸长终止之前，聚合酶会将其中一个或多个添加到寡核苷酸上，而这很容易是错误的二脱氧核苷三磷酸，这肯定会导致扩展产物的大小错误，结果是假的。manbet手机版这是不行的。manbet手机版我需要一种方法来确保样本不受脱氧核苷三磷酸盐的污染。manbet手机版我可以用细菌碱性磷酸酶处理延伸反应前的样品。manbet手机版这种酶会将存在的任何三磷酸分解成核苷，从而不会干扰主反应，但然后我需要“在加入二脱氧核苷三磷酸之前使磷酸酶失活，当时所有人都知道，我们所说的BAP，不会被热不可逆地变性。”manbet手机版我们知道这一点的原因是，在经典的实验中已经证明了热变性BAP的复性，表明蛋白质的形状是由它的序列决定的。manbet手机版经典的还原实验是在含有大量锌的缓冲液中进行的。 What had not occurred to me or apparently many others was that BAP could be irreversibly denatured if zinc was omitted from the buffer, and that zinc was not necessary in the buffer if the enzyme was only going to be used for a short time and had its own tightly bound zinc to begin with. There was a product on the market at the time called matBAP wherein the enzyme was attached to an insoluble matrix which could be filtered out of a solution after it had been used. The product sold because people were of the impression that you could not irreversibly denature BAP. We’d all heard about, but not read, the classic papers.

manbet手机版这说明了许多科学事实建立的武断方式，但对于这个故事来说，唯一重要的是，如果我当时知道BAP可以不可逆地热变性，我可能会错过PCR。manbet手机版事实上，我决定不使用BAP，并试图想出另一种方法来摆脱脱氧核苷三磷酸。manbet手机版我想，这个怎么样?manbet手机版如果我去掉放射性的二脱氧核苷三磷酸，把DNA样本和寡核苷酸混合，放入聚合酶，然后等待呢?manbet手机版聚合酶将所有的脱氧核苷三磷酸加到杂化寡核苷酸上，以耗尽它们。manbet手机版完成后，我可以加热混合物，使扩展寡核苷酸从目标移走，然后冷却混合物，让新的，未扩展的寡核苷酸杂交。manbet手机版扩展的寡核苷酸数量将远远超过大量的未扩展的寡核苷酸，因此不会在很大程度上与靶基因重新杂交。manbet手机版然后我会加入二脱氧核苷三磷酸混合物，以及另一种聚合酶。manbet手机版现在一切都可以了。

manbet手机版但是如果最初的延伸反应中的寡核苷酸被延伸到如此之远，它们现在可以在第二轮中与极性相反的未延伸的寡核苷酸杂交。manbet手机版它们被扩展到的顺序将允许这一点。manbet手机版将会发生什么?

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manbet手机版尤里卡! !manbet手机版我可以故意这么做，加入我自己的脱氧核苷三磷酸，这在加州是可溶于水的，是合法的。

manbet手机版再一次,尤里卡! !manbet手机版我可以一遍又一遍地做。manbet手机版每次我这样做，信号都会加倍。manbet手机版迷路的朋友们，我们回来了!manbet手机版我把车停在128号公路的46,7英里标志牌处。manbet手机版我在仪表柜里找到了一些纸和一支笔。manbet手机版我证实了2的10次方大约是1000,2的20次方大约是100万，2的30次方大约是10亿，接近人类基因组中的碱基对的数量。manbet手机版一旦我把这个反应循环了30次，我就可以用一个巨大的信号和几乎没有背景的样品序列。

manbet手机版詹妮弗想走了。manbet手机版我继续沿着这条路开下去。manbet手机版在大约一英里的距离内，我突然想到寡核苷酸可以被放置在彼此之间的任意距离上，而不仅仅是在碱基对的侧边，我可以对我选择的任何序列复制任意数量的副本，而且，经过几次循环后，大多数副本的大小都是相同的。manbet手机版大小由我决定。manbet手机版它们看起来像凝胶上的限制性片段。manbet手机版我又停下了车。

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manbet手机版下午到了，我从杰克山谷商店买了几瓶庆祝用的红色液体，但我仍然困惑不解，时而为自己的好运气和聪明的大脑感到绝对的高兴，时而又为自己和詹妮弗·巴奈特感到有点恼火，因为他们没有看到一定存在的缺陷。manbet手机版我在小木屋里没有电话，在安德森谷除了詹妮弗和我之外，也没有其他的生物化学家。manbet手机版这个难题一直萦绕着整个周末，让我产生了一种前所未有的渴望，想早点回去工作。manbet手机版如果现在在船舱里以各种方式象征的循环反应真的有效，为什么我从来没有听说过它们被使用?manbet手机版如果它们被使用了，我肯定会听说的，其他人也会听说的，包括詹妮弗，她正在池塘边晒太阳，对我脑子里的爆炸声丝毫不感兴趣。

manbet手机版为什么这些反应不起作用?

manbet手机版星期一早上我在图书馆。manbet手机版关键时刻到了。manbet手机版到了下午，天就放晴了。manbet手机版无论出于何种原因，在抽象的文献中，并没有关于通过将两个引物杂交到特定DNA序列的分离链上的重复相互延伸来成功或失败地扩增DNA的内容。manbet手机版到周末的时候，我已经和足够多的分子生物学家谈过了，我知道我没有错过任何真正明显的东西。manbet手机版没有人记得曾经尝试过这种方法。

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manbet手机版我在电脑里有一个目录，里面都是未经验证的想法。manbet手机版我打开一个新文件，命名为聚合酶链式反应。manbet手机版我没有立即进行实验，但整个夏天我都在和公司内外的人交谈。manbet手机版我在8月份的一次内部研讨会上描述了这个概念。manbet手机版每一个鲸群科学家每年都要做两次演讲。manbet手机版但没有人需要听。manbet手机版大多数的谈话都是对分娩过程的干巴巴的描述，大多数科学家都早早地离开了，没有发表任何评论。

manbet手机版有一两个技术人员对此感兴趣，在詹妮弗还爱着我的日子里，她认为这可能行得通。manbet手机版在她恨我的日子越来越多的时候，我的思想和我一起忍受着她的嘲笑。

manbet手机版我继续谈论它，到夏末的时候，我有了一个计划，要扩增一个400 bp的人类神经生长因子片段，基因泰克已经克隆并发表在manbet手机版自然manbet手机版．manbet手机版我会从Sigma的整个人类胎盘DNA开始。manbet手机版他冒着从单个外显子衍生出cDNA序列的风险。manbet手机版不需要cDNA文库。manbet手机版没有殖民地，什么都没有。manbet手机版这将是戏剧性的。manbet手机版我要飞到月亮上去。manbet手机版在我的实验室里，引物很容易得到，为整个公司制造了寡核苷酸。manbet手机版我把我想要的序列输入电脑，并把它们移到等待列表的前面。

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manbet手机版总之，我和詹妮弗之间的问题并没有得到改善。manbet手机版那天晚上也不例外。manbet手机版我独自开车回家，感到悲伤和不安，没有心情离开我的工作，或任何大的变化，我的生活中仅存的稳定。manbet手机版和我们空荡荡的房子相比，聚合酶链反应显得遥远而渺小。

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